光束勻化在熒光成像平場照明中的應(yīng)用

熒光顯微鏡

熒光顯微鏡屬于光學(xué)顯微鏡家族，基于熒光的物理效應(yīng)。利用了所謂的熒光染料的顏色特性，它們被特定波長的光激發(fā)，并以不同的波長再次反射吸收的光。

熒光顯微鏡的應(yīng)用

熒光顯微鏡可以進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究、納米范圍內(nèi)的測量值分析以及實(shí)時可見的大多數(shù)不同文化的過程。無論是在生物化學(xué)、生物物理學(xué)還是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：快速、詳細(xì)地檢測明亮、多彩的熒光有助于熒光顯微鏡的測量過程，并為新發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。zui 佳測量結(jié)果和zui 佳分辨率需要zui精確的光學(xué)器件——無論是通過光束路徑的優(yōu)化和聚焦、精確安裝的濾光片還是高質(zhì)量的鍍膜。

熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)和功能原理

允許個別波長通過的特殊濾光片可確保熒光顯微鏡下熒光的可視化。熒光顯微鏡的特殊濾光片包括：

勵磁濾光器

發(fā)射過濾器

二向色分束器

單獨(dú)的激發(fā)濾光片允許相應(yīng)波長的光通過，這是激發(fā)待檢樣品中特定染料所必需的。二向色鏡將刺激波長反射到物鏡，物鏡將光束集中到標(biāo)本上。從標(biāo)本反 射的光集中在物鏡中，在其激發(fā)態(tài)通常具有比入射光更高的波長。通過二向色鏡，反射光通過發(fā)射濾光片并降低到發(fā)射波長。尚未在二向色鏡處停止的刺激光的殘留物在發(fā)射濾光片處被過濾掉。理想情況下，只有發(fā)射光撞擊顯微鏡內(nèi)置的檢測器，并以相應(yīng)的顏色可見。zui 佳測量結(jié)果需要均勻的照明，尤其是當(dāng)需要幾微米或幾毫米的大視野時。在不均勻照明的情況下，例如，可能發(fā)生待檢查分子的不均勻激活。結(jié)果：中心的分子比入射照明光束外圍的分子發(fā)出更強(qiáng)烈的熒光。如果周邊沒有與中心等同地照亮，則當(dāng)單獨(dú)記錄的圖像網(wǎng)格稍后合并時，陰影繼續(xù)出現(xiàn)。因此，細(xì)胞和組織樣本等測量不能用于可靠的分析。這些問題可以通過使用 a|TopShapea|BeamExpander 來解決。通過使用非球面可以實(shí)現(xiàn)這些元素在系統(tǒng)中。我們的系統(tǒng)以其緊湊的設(shè)計(jì)、精度和zui高的光學(xué)質(zhì)量而令人信服。使用光學(xué)組件a|TopShape 和 a|BeamExpander 可以將高斯光束轉(zhuǎn)換為均勻的平頂輪廓，從而在整個視野中實(shí)現(xiàn)均勻照明。所產(chǎn)生的平場照明具有高空間相干性、wu與倫bi的光學(xué)性能和 > 95% 的高均勻性。分子的均勻激發(fā)和zui小的圖像重疊 (5%) 可以保證讓您wan全滿意。

下圖顯示了熒光顯微鏡的工作原理和一般結(jié)構(gòu)。

熒光顯微鏡的工作原理

熒光顯微鏡應(yīng)用

基于激光的熒光顯微鏡內(nèi)的定量分析可能會因高斯光束輪廓產(chǎn)生的不均勻 照明而變得復(fù)雜。光源和照明光學(xué)等因素會影響均勻性。當(dāng)要檢查大視野 (FOV)時，這些功能尤其具有挑戰(zhàn)性。測量圖像由圖像網(wǎng)格在熒光顯微鏡中生成。以邊緣重疊的方式獲取單個圖像，并且可以在后處理中組合它們。如果照明不均勻，zui終圖像的每個單獨(dú)圖像周圍都會有變暗的邊緣 - 細(xì)胞和組織樣本的測量變得不可靠。光照不均勻的另一個缺點(diǎn)：分子激活不均勻。那些靠近光束中心的熒光比邊緣的熒光更多。位于奧蘭多的中佛羅里達(dá)大學(xué)光學(xué)與光子學(xué)院的一個研究團(tuán)隊(duì)通過將aphericon 的光束整形器 a|TopShape 和 a|BeamExpander 集成到顯微鏡裝置中，從而克服了這些問題。平場照明 (FFI) 設(shè)置將高斯光束塑造成統(tǒng)一的平頂輪廓。a|TopShape 對入射激光束大小的變化具有ji高的容忍度 (± 10 %)，并且以消色差方式運(yùn)行。非常好的光學(xué)性能（均勻性 > 95%）可實(shí)現(xiàn)均勻照明，從而激活分子。此外，F(xiàn)FI 設(shè)置可實(shí)現(xiàn)無邊界拼接成像，圖像重疊zui小 (5%)。

定量熒光成像的平場照明

項(xiàng)目介紹：

高斯輪廓的不均勻光照使得基于激光的寬視場熒光顯微鏡的定量分析具有很高的挑戰(zhàn)性。許多因素，包括光源和照明光學(xué)有助于均勻性。當(dāng)需要幾百微米或毫米尺度的大視場時，這些特性尤其困難。獲得一個圖像網(wǎng)格，使邊界重疊，并在后處理中將圖像拼接在一起。如果光照不均勻，zui終拼接的圖像在每個單獨(dú)的圖像周圍都有暗淡的邊界。因此，細(xì)胞和組織樣本的測量是不可靠的。非均勻光照的另一個缺點(diǎn)是分子的不均勻激活。那些zui靠近光束中心的人比那些靠近邊緣的人熒光更強(qiáng)烈。

項(xiàng)目實(shí)施：

來自美國佛羅里達(dá)州奧蘭多市中佛羅里達(dá)大學(xué)光學(xué)與光子學(xué)學(xué)院的一個研究團(tuán)隊(duì)，在他們的顯微鏡設(shè)置中使用非球面 TopShape 和 BeamExpander 時，可以克服這些問題(b)，這兩個都是由非球面組成的非常緊湊和高精度的折光光學(xué)組件。因此，他們能夠呈現(xiàn)平場照明(FFI)，其中高斯光束被塑造成一個均勻的平頂輪廓(a)。光束整形裝置非常容忍入射激光束的大小變化，接受±10%，同時也是消色差的(e)。FFI 的工作距離(f)長，空間相干性高，可以在多色單分子成像中實(shí)現(xiàn)均勻的 epi1 和 TIRF2 照明。所使用的光學(xué)器件具有吳與倫bi的光學(xué)性能，均勻性> 95%，允許均勻的照明(c & d)，從而均勻地激活分子。此外，F(xiàn)FI 實(shí)現(xiàn)了zui小圖像重疊(5%)的無界縫合成像。

說明: 1,外延照明模式是指從樣品的一側(cè)進(jìn)行照明和檢測;

審核編輯 黃宇